Dna bổ sung là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Định nghĩa DNA bổ sung (cDNA)

DNA bổ sung (cDNA - complementary DNA) là dạng DNA được tổng hợp từ khuôn RNA thông tin (mRNA) thông qua enzyme reverse transcriptase. Đây không phải là DNA có sẵn trong bộ gen tế bào, mà được tạo ra nhân tạo trong phòng thí nghiệm với mục tiêu nghiên cứu hoặc ứng dụng sinh học phân tử.

Khác với DNA hệ gen (gDNA) có chứa cả exon và intron, cDNA chỉ bao gồm các đoạn mã hóa (exon) vì mRNA làm khuôn cho nó đã trải qua quá trình xử lý RNA (RNA splicing) để loại bỏ intron. Do đó, cDNA phản ánh chính xác phần thông tin di truyền đã được biểu hiện tại một thời điểm cụ thể trong tế bào.

Vì chỉ đại diện cho các gen đang hoạt động, cDNA là công cụ lý tưởng để nghiên cứu biểu hiện gen, biểu hiện protein và các thay đổi chức năng trong các mô hoặc dòng tế bào khác nhau, đặc biệt trong nghiên cứu ung thư, miễn dịch và sinh học phát triển.

Quá trình tổng hợp cDNA từ mRNA

Tổng hợp cDNA bắt đầu bằng việc chiết tách mRNA tổng số từ mẫu mô hoặc tế bào. Do mRNA có cấu trúc không ổn định và dễ phân hủy, bước này cần sử dụng các phương pháp bảo quản lạnh và chất ức chế RNase để bảo toàn mẫu. Sau khi phân lập, mRNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription).

Enzyme reverse transcriptase sẽ tổng hợp một sợi DNA mới từ sợi mRNA theo nguyên tắc bổ sung base (A ↔ T/U, G ↔ C). Sau đó, enzyme DNA polymerase I (hoặc các enzyme liên quan) tiếp tục tổng hợp sợi bổ sung thứ hai để tạo thành phân tử DNA sợi đôi hoàn chỉnh.

Quy trình chuẩn có thể mô tả như sau:

1. Ly giải tế bào và chiết RNA tổng số.
2. Lọc chọn mRNA thông qua poly-A tail (dùng hạt oligo-dT).
3. Phiên mã ngược mRNA → cDNA sợi đơn bằng reverse transcriptase.
4. Hoàn thiện cDNA sợi đôi nhờ DNA polymerase và RNase H.

Bảng sau trình bày các thành phần cơ bản trong phản ứng tổng hợp cDNA:

Thành phần	Vai trò
mRNA	Khuôn để tổng hợp DNA bổ sung
Oligo(dT) hoặc random primers	Khởi đầu phản ứng phiên mã ngược
Reverse transcriptase	Tổng hợp sợi cDNA từ khuôn RNA
dNTPs	Nguyên liệu xây dựng chuỗi DNA
Buffer phản ứng	Duy trì điều kiện tối ưu cho enzyme

Sự khác biệt giữa cDNA và DNA gốc trong tế bào

DNA gốc trong nhân tế bào người (genomic DNA – gDNA) chứa toàn bộ bộ gen, bao gồm cả các vùng điều hòa (promoter), intron, exon, và các vùng không mã hóa. Trong khi đó, cDNA chỉ được tổng hợp từ phần mRNA đã qua xử lý, tức là chỉ chứa các đoạn exon liên tục.

Vì lý do đó, cDNA thường có độ dài ngắn hơn rất nhiều so với gen gốc trong hệ gen, và thuận tiện hơn khi dùng cho các mục đích biểu hiện gen trong hệ vi sinh vật (E. coli, yeast), vốn không có cơ chế xử lý intron như tế bào nhân chuẩn. Đây là lợi thế then chốt trong sản xuất protein tái tổ hợp.

Một số khác biệt chính được tóm tắt như sau:

Tiêu chí	Genomic DNA (gDNA)	Complementary DNA (cDNA)
Cấu trúc	Có cả intron và exon	Chỉ có exon
Nguồn gốc	Chiết từ nhân tế bào	Tổng hợp từ mRNA
Ứng dụng	Phân tích di truyền, đột biến	Biểu hiện gen, phân tích phiên mã
Độ dài	Dài hơn, có vùng không mã hóa	Ngắn hơn, liên tục

Ứng dụng của cDNA trong nghiên cứu gen

cDNA là công cụ nền tảng trong sinh học phân tử hiện đại. Nó được sử dụng trong nhiều kỹ thuật phân tích và phát hiện biểu hiện gen như RT-PCR, qPCR, giải trình tự RNA (RNA-seq), và microarray. Các ứng dụng này cho phép nghiên cứu những thay đổi biểu hiện gen trong các điều kiện bệnh lý, phát triển, hoặc đáp ứng với thuốc.

Một số ứng dụng tiêu biểu:

• Phân tích mức độ biểu hiện của gen đích bằng qPCR.
• Tạo thư viện cDNA để nghiên cứu toàn bộ transcriptome.
• Biểu hiện protein người trong hệ thống vi sinh để nghiên cứu cấu trúc hoặc sản xuất dược phẩm.

Ví dụ: trong sản xuất insulin tái tổ hợp, cDNA của gen insulin được chèn vào plasmid và đưa vào vi khuẩn E. coli để biểu hiện protein. Do cDNA không có intron, quá trình phiên mã – dịch mã diễn ra trơn tru mà không cần chỉnh sửa RNA như trong tế bào người.

Vai trò của enzyme reverse transcriptase

Reverse transcriptase là enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp DNA từ khuôn RNA, một quá trình ngược với dòng thông tin di truyền truyền thống DNA → RNA → Protein. Enzyme này được phát hiện trong các retrovirus như HIV, nơi chúng sử dụng reverse transcriptase để tích hợp vật liệu di truyền RNA của mình vào bộ gen tế bào chủ. Phát hiện này đã mở ra lĩnh vực nghiên cứu phiên mã ngược trong sinh học phân tử, cho phép tổng hợp cDNA trong phòng thí nghiệm.

Enzyme reverse transcriptase được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật như tổng hợp cDNA, RT-PCR, RNA-seq và tạo thư viện cDNA. Các phiên bản enzyme thương mại như SuperScript III/IV của Thermo Fisher hoặc enzyme của New England Biolabs (NEB) thường có độ ổn định nhiệt cao, tốc độ tổng hợp nhanh và mức độ chính xác lớn hơn so với enzyme tự nhiên.

Trong phản ứng phiên mã ngược, reverse transcriptase tuân theo nguyên lý bổ sung base giống polymerase: $\text{A} \leftrightarrow \text{T}, \quad \text{U} \rightarrow \text{A}, \quad \text{G} \leftrightarrow \text{C}$ Enzyme này cũng mang hoạt tính RNase H trong nhiều trường hợp, giúp phân giải RNA trong phức hợp RNA–DNA sau khi tạo xong sợi cDNA đầu tiên, từ đó hỗ trợ quá trình tổng hợp sợi DNA thứ hai.

Thư viện cDNA là gì?

Thư viện cDNA (cDNA library) là tập hợp các phân tử cDNA đại diện cho toàn bộ tập hợp mRNA đang được biểu hiện trong một loại tế bào hoặc mô tại thời điểm thu mẫu. Khác với thư viện DNA hệ gen (gDNA library), thư viện cDNA chỉ chứa các đoạn mã hóa liên tục, không có intron và không có promoter hoặc vùng điều hòa. Điều này giúp thư viện cDNA trở thành công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu chức năng gen.

Quy trình xây dựng thư viện cDNA gồm các bước:

1. Chiết tách mRNA và tổng hợp cDNA sợi đôi.
2. Gắn cDNA vào vector thích hợp (plasmid, lambda phage).
3. Biến nạp vector vào vi khuẩn hoặc hệ thống lưu trữ.
4. Phân lập và sắp xếp các clone để tạo kho dữ liệu cDNA hoàn chỉnh.

Thư viện cDNA được dùng để:

• Xác định trình tự gen đang được biểu hiện trong mô.
• Tạo vector biểu hiện protein tái tổ hợp.
• Phát hiện isoform mới của gen hoặc biến thể phiên mã (transcript variants).

Các dự án lớn như Human ORFeome Project đã sử dụng thư viện cDNA để mô tả hàng ngàn gen người phục vụ nghiên cứu y sinh học và phát triển thuốc.

cDNA trong phản ứng RT-PCR

RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) là phương pháp kết hợp phiên mã ngược để tạo cDNA và PCR để khuếch đại gen quan tâm. Đây là kỹ thuật nền tảng trong sinh học phân tử, đặc biệt trong chẩn đoán lâm sàng và nghiên cứu biểu hiện gen.

Quy trình RT-PCR gồm hai pha chính:

1. Tổng hợp cDNA từ mRNA bằng reverse transcriptase.
2. Khuếch đại cDNA qua chu trình nhiệt PCR.

Kết quả RT-PCR cho phép phát hiện sự có mặt của RNA đích và công bố mức biểu hiện tương đối của gen.

Trong dịch tễ học, RT-PCR là phương pháp tiêu chuẩn vàng để phát hiện virus RNA như SARS-CoV-2, cúm A, RSV. Nhờ cDNA trung gian, kỹ thuật này khuếch đại trình tự RNA virus với độ nhạy rất cao. Các bộ kit thương mại của Thermo Fisher hoặc Roche được sử dụng rộng rãi trong bệnh viện và phòng xét nghiệm.

cDNA và kỹ thuật giải trình tự RNA (RNA-seq)

RNA-seq là kỹ thuật giải trình tự toàn bộ transcriptome. Vì hầu hết nền tảng giải trình tự hiện nay chỉ đọc DNA, RNA phải được chuyển đổi qua cDNA trước khi xử lý. Sau bước phiên mã ngược, cDNA được phân mảnh, gắn adaptor và đưa vào máy giải trình tự như Illumina NovaSeq hoặc NextSeq.

RNA-seq cung cấp dữ liệu về:

• Mức độ biểu hiện của từng gen.
• Các biến thể phiên mã (alternative splicing).
• Gen hợp nhất (fusion gene) liên quan ung thư.
• RNA không mã hóa (ncRNA) và các dạng RNA điều hòa.

Ứng dụng RNA-seq rất rộng, từ phân tích cơ chế bệnh ung thư, miễn dịch, virus, đến nghiên cứu tiến hóa phân tử. Công nghệ này được mô tả chi tiết bởi Illumina – nhà cung cấp nền tảng RNA-seq phổ biến nhất hiện nay.

Ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học

cDNA là nguyên liệu nền tảng để sản xuất protein tái tổ hợp – một trong những trụ cột của công nghệ sinh học hiện đại. Khi cDNA của một gen người được chèn vào vector biểu hiện và đưa vào tế bào chủ như E. coli hoặc dòng tế bào CHO, hệ thống sẽ tổng hợp protein tương ứng, từ đó phục vụ nghiên cứu hoặc sản xuất dược phẩm.

Một số ứng dụng nổi bật:

• Sản xuất insulin tái tổ hợp cho bệnh nhân tiểu đường.
• Tạo hormone tăng trưởng người (hGH).
• Biểu hiện kháng thể đơn dòng phục vụ điều trị ung thư.
• Nghiên cứu gen đích trong liệu pháp gene.

Trong chẩn đoán ung thư, phân tích cDNA giúp xác định mức độ hoạt động của các gen đánh dấu (biomarkers) và phát hiện bất thường trong quá trình phiên mã. Trong phát triển vaccine DNA và vaccine mRNA, cDNA đóng vai trò quan trọng trong việc tạo vector cung cấp trình tự thông tin mã hóa protein kháng nguyên.

Tài liệu tham khảo

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Alberts, B. et al. (2014). Molecular Biology of the Cell (6th ed.). Garland Science.
3. Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). RNA: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
4. Thermo Fisher Scientific – cDNA Synthesis Overview
5. NCBI – Reverse Transcriptase: Molecular Mechanisms and Inhibition
6. Illumina – RNA Sequencing Introduction